在线股票配资分红 单细胞多组学揭示肺腺癌对EGFR治疗产生耐药性机制_器官_患者_研究

肺癌是癌症死亡的主要原因，携带EGFR突变的肺腺癌（LUAD）患者初始对靶向药物EGFR-TKI反应良好，但几乎都会在1-2年内产生耐药性。尽管部分耐药机制（如二次基因突变、组织学转化）已被阐明，但近半数耐药患者的机制仍不明确。深入研究非遗传性耐药机制，对于开发克服耐药的新策略至关重要。

2025年5月11日，日本庆应义塾大学Toshiro Sato和Hiroyuki Yasuda团队联合多机构在Nature Communications发表题为《Basal-shift transformation leads to EGFR therapy-resistance in human lung adenocarcinoma》的研究论文。该研究利用患者来源的EGFR突变肺癌类器官（ELCOL）生物库，结合单细胞转录组测序（scRNA-seq）等组学技术，首次揭示了一种全新的EGFR-TKI耐药机制——“基底样转换”（Basal-shift），并发现靶向CDK4/6是克服此类耐药的有效策略。

文章系统研究了EGFR突变肺腺癌（LUAD）患者对EGFR-TKI（尤其是奥希替尼）产生耐药的新机制。研究团队首先构建了一个包含39个类器官系、源自31名患者的独特生物库（ELCOL），涵盖了治疗前、治疗后（耐药）样本及多种组织学转化类型（如鳞状细胞癌SQ、小细胞肺癌SCLC转化）。通过整合全外显子测序（WES）、转录组分析（包括bulk RNA-seq和关键的 单细胞RNA测序（scRNA-seq） 、ATAC-seq和功能验证，他们发现了一类缺乏已知耐药基因突变（如T790M, C797S）的耐药亚群。深入分析揭示这些类器官和患者肿瘤表现出一种独特的“基底样转换”（basal-shift）表型：同时（但常为异质性）表达部分LUAD标志物（如AQP5）和鳞状标志物（如TP63），介于典型LUAD和SQ之间。基因工程实验（CRISPR-KO）证明，肺泡谱系关键转录因子NKX2-1（TTF-1）的缺失是驱动这种表型转换和获得EGFR-TKI耐药的核心机制。进一步研究发现，具有basal-shift表型的LUAD常伴随CDKN2A/B缺失，并对CDK4/6抑制剂（如帕博西利）高度敏感，这在小鼠移植瘤模型中得到了验证。最后，临床样本回顾性分析证实了basal-shift表型在耐药患者中的存在。该研究不仅发现了一种重要的新型非遗传性耐药机制（basal-shift），建立了宝贵的类器官资源库（ELCOL），并为克服此类耐药提供了靶向CDK4/6的潜在治疗策略。

1. 构建耐药类器官库，揭示未知耐药机制比例高

为了创建一个代表肺癌中对EGFR-TKI的临床耐药性并涵盖多种耐药机制的生物学平台，作者建立了39个肺癌类器官系，这些细胞系来自31名已知患有EGFR突变型肺癌的患者。通过各种方法获得临床标本，包括手术切除、胸腔积液引流、支气管镜检查、CT引导活检、腹水穿刺、脑脊液穿刺和尸检（图1a，补充图1a，B）。每例患者的详细临床信息见补充数据1。所有的器官系都经过了6个月以上的稳定繁殖。在这些患者中，28例接受了EGFR-TKI治疗，包括奥希替尼或其他EGFR-TKI。3例患者提供了在EGFR-TKI治疗前后采集的纵向样本，使作者能够从相同患者中建立2个（E-01 A和E-01 B）、6个（E-02 A-F）和2个（E-04 A和E-04 B）系列（图1a，B）。LUAD衍生的类器官和异种移植肿瘤表现出特征性LUAD样形态学，伴有NKX 2 -1（TTF-1）表达。值得注意的是，EGFR-TKI处理肿瘤的5个器官系发生了组织学转化，表现为SQ、大细胞神经内分泌癌（LCNEC）或SCLC（图1b-d）。在这些转化的病例中，组织病理学特征在类器官、异种移植物和原始肿瘤中是保守的。具体而言，SQ转化的（SQ-T）类器官及其异种移植物表现出腺体结构、多边形细胞巢和鳞状细胞标志物Δ Np 63（p40）表达的丧失，而LCNEC或SCLC转化的（SCLC-T）类器官表达神经内分泌标志物。作者的EGFR突变型肺癌类器官库（ELCOL）的组织学多样性和详细的临床注释突出了其作为研究靶向EGFR-TKI耐药肺癌策略的独特资源的价值。

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图1：转录组分析揭示EGFR-TKI耐药肺癌的基底细胞样亚型

2. 单细胞转录组鉴定“基底样转换”耐药新亚型

为了研究基因变异与EGFR-TKI敏感性之间的关系，作者对肺癌类器官进行了全外显子组测序（WES）。WES分析证实了所有器官系中EGFR突变的存在及其与亲代肿瘤标本中突变的对应性（图2a）。SCLC-T类器质性病变也与腺癌具有相同的EGFR突变，支持它们的共同起源。治疗后标本仅携带EGFRT 790 M和EGFRC 797 S突变，分别与对第1/2代和第3代EGFR-TKIs 7、20、21、27的耐药相关，与临床耐药一致。RB 1突变在ELCOL（7/36株）中比TCGA群体40中更普遍。与RB 1突变作为SCLC 41驱动因素的作用一致，从SCLC-T病例中衍生出3株RB 1突变株。有趣的是，一个RB 1突变株系是从一个未经治疗的LUAD患者（E-07）中建立的，该患者在EGFR-TKI治疗后复发并发生SCLC转化。该细胞系显示神经内分泌分化转录因子42 ASCL 1表达增加（补充图2a），表明LUAD中RB 1突变可能在EGFR-TKI治疗前易导致SCLC转化。WES分析还发现了与EGFR-TKI耐药相关的其他微小基因变异，如MET扩增、BRAF融合和CDK 4扩增。ELCOL中的16个细胞系表现出CDKN 2A/B的缺失，与EGFR-TKI处理无关（图2a）。基于WES的拷贝数分析显示了跨越EGFR基因座的7 p染色体区域的复发性增益（补充图2b）。这些结果表明，ELCOL涵盖了与EGFR-TKI耐药相关的多种遗传变异。然后对建立的类器官进行奥希替尼处理（图2b）。IC 50值与基于RECIST标准的临床缓解的比较显示，临床耐药肿瘤（EGFR-TKI治疗后SD/ PD）的类器官对奥希替尼的耐药性高于临床缓解肿瘤（CR/PR）的类器官（图2b）。奥希替尼处理诱导奥希替尼敏感性E-01 A类器官细胞凋亡，但未诱导耐药E-14类器官细胞凋亡（图2c）。作为一个恰当的例子，来自奥希替尼暴露肿瘤的E-01 B细胞系对奥希替尼的耐药性高于其未接受过治疗的对应细胞系E-01 A（图2d，e）。约三分之二的来自EGFR-TKI治疗肿瘤的EGFR突变株系缺乏已知与EGFR-TKI耐药相关的其他遗传病变，与既往研究一致（图2f，补充图2c）12。这些没有二次遗传损伤的EGFR-TKI抗性品系包括已经经历了SCLC、LCNEC或SQ的组织学转化的类器官。然而，半数病例的EGFR-TKI耐药机制仍不清楚。这些结果强调了患者来源的肺癌类器官在药物敏感性试验中的潜力，以及仅基于基因组学预测EGFR-TKI临床应答的局限性。

中间体是EGFR-TKI抗性品系，缺乏抗性相关遗传改变。这一独特的中间人群的出现促使作者探索与EGFR-TKI耐药相关的基因程序。比较转录组分析发现，与前EGFR-TKI LUAD类器官相比，中间类器官中SQ标记物（如KRT 5、KRT 14、NGFR和TP 63）部分上调（图3b）。与鳞状细胞相关的基因本体术语，如表皮和皮肤，在上调基因中富集。与SQ-T类器官不同，中间群体在一定程度上保留了肺泡标志基因的表达（图3b）。使用SQ类器官与前EGFR-TKI LUAD类器官中上调的基因进行的基因集富集分析验证了与前EGFR-TKI LUAD类器官相比，中间LUAD类器官中SQ基因的富集增加（图3c）。通过测序（ATAC-seq）分析转座酶可及染色质，进一步揭示了中间LUAD类器官中SQ特异性ATAC峰的去阻遏（图3d）。这些数据表明，EGFR-TKI耐药的LUAD类器官没有已知的遗传损伤，部分获得了SQ样特性，同时通过转录组和表观基因组重塑保留了LUAD性状。尽管这些结果表明，杂交SQ/LUAD同一性表征了中间群体，但由于整体转录组分析的分辨率有限，它是否反映了包含类SQ和LUAD细胞的肿瘤异质性，或共表达两种谱系标记物的同质细胞仍不清楚。为了解决这个问题，作者对总共8个类器官系进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，包括2个LUAD（E-01 A、E-05）、2个SQ（KOR 386、KOR 484）、1个SQ-T（E-12）和3个中间型LUAD类器官（E-14、E-17和E-20）（图3e）。统一流形近似和投影（UMAP）后的数据整合描述了三个不同的亚组，每个亚组对应于LUAD、SQ/SQ-T和中间LUAD（图3e）。基底移位LUAD类器官的异种移植瘤保持AQP 5和TP 63的表达，排除了基底移位表型是体外培养伪影的可能性。作者进一步证实了在奥希替尼治疗后，AQP 5和Δ Np 63在E-23患者的肿瘤中的同时表达（图3g）。这些结果共同表明LUAD肿瘤采用基线漂移作为耐受EGFR-TKI治疗的策略之一。该研究为LUAD肿瘤的治疗提供一定参考。该研究为LUAD肿瘤的治疗提供一定参考。

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图2：肺癌类器官中EGFR-TKI耐药的遗传决定因素

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图3：EGFR-TKI耐药LUAD类器官中的碱基移位转化

3. NKX2-1缺失驱动基底样转换与耐药

为了更好地理解基底移位转化沿着EGFR-TKI耐药的分子机制，作者探索了可能导致基底移位表型的遗传改变。基线偏移与非基线偏移、EGFR-TKI处理的LUAD类器官中的遗传改变的分析显示，基线偏移LUAD类器官中CDKN 2A/B丢失的频率更高（图4a）。为了阐明EGFR-TKI治疗后CDKN 2A/B缺失细胞是否重新融合，作者使用免疫组织化学分析了原始癌组织中的CDKN 2A（p16）表达，这表明EGFR-TKI治疗前p16表达丧失（图4 b）。CDKN 2 A/B缺失的类器官系E03、E-05和E-06在体外对奥希替尼相对敏感（图2 B），其亲本肿瘤也显示对EGFR-TKI治疗的临床应答。此外，作者先前进行的人正常肺泡类器官中的TP 53和CDKN 2A（TC）敲除38未能诱导基底移位表型。因此，CDKN 2 A/B的缺失不足以进行碱基移位转化和获得EGFRTKI抗性。为了鉴定基底移位的其他非遗传介质，作者检查了常规和基底移位LUAD类器官的ATAC-seq谱。差异可及ATAC-seq峰的基序分析揭示了两种LUAD类器官类型之间不同的转录因子（TF）活性（图4c）。与基底移位LUAD类器官中的基底样基因表达模式一致，它们表现出调节鳞状细胞身份的GRHL 2和TP 63活性增加。为了研究单独的TP 63活化是否赋予EGFR-TKI抗性，作者在具有EGFR突变的两个EGFR-TKI-未处理的LUAD类器官系（E-01 A和E-05）中过表达TP 63。然而，TP 63的过表达没有改变对奥希替尼的敏感性，表明单独的TP 63活化不会通过基底转移转化赋予EGFR-TKI抗性。有趣的是，基底移位LUAD类器官也显示出NKX 2 -1活性降低，NKX 2 -1是肺泡特性的TF。RNA-seq和免疫组织化学证实了基底移位LUAD类器官中NKX 2 -1的表达降低（图4d）。为了确定NKX 2 -1丢失在基底移位转化中的作用，作者将靶向NKX 2 -1的sgRNA引入具有EGFR突变的未经治疗的LUAD类器官系（E-01 A、E-05和E-06）在暴露于奥希替尼一个月后，NKX 2 -1敲除的类器官显示TP 63及其靶基因的上调（补充图7 b，g）。NKX 2 -1敲除的类器官也获得了对奥希替尼的抗性（补充图7 h）。这些结果表明，缺陷NKX 2 -1不仅通过从头TP 63表达介导基础移位转化，而且对于EGFR-TKI抗性也是必需的。为了进一步研究NKX 2 -1丢失在基底移位中的作用，作者利用了人肺泡上皮细胞的基因工程，其用作LUAD的起源细胞，并通过在基底移位LUAD类器官中引入EGFR和ERK的NKX 2 -1磷酸化来产生TC-NKX 2 -1三重敲除（TCN）人肺泡类器官，尽管未能抑制它们的生长（补充图8d）。在转录组水平上，Osimertinib治疗后，初治和基底转移均显示出即时应答基因的上调，而复制相关基因仅在初治类器官中下调（补充图8 e）。这些结果表明，基底移位和气道类器官可以独立于酪氨酸激酶受体及其下游信号激活而生长。总之，在持续EGFR抑制的背景下，NKX 2 -1的缺失使肺泡细胞向基底细胞样状态转化，并改变了细胞自主生态位依赖性，从而提供EGFR途径的独立性。

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图4：NKX 2 -1缺失介导EGFR-TKI耐药性

4. CDK4/6抑制剂靶向治疗基底样转换耐药

为了探索对具有EGFR-TKI抗性的基底移位LUAD具有潜在治疗效果的候选药物，作者使用两种非基底移位LUAD类器官系和三种基底移位类器官系对靶向致癌途径的54种小分子化合物进行了高通量筛选43（补充数据2）。与基底移位LUAD中CDKN 2 A/B的频繁丢失一致，筛选显示基底移位类器官中对CDK抑制剂（包括CDK 4/6抑制剂（Palbociclib和Abemaciclib））的敏感性高于非基底移位类器官（图5a）。正如预期的那样，生长迟缓由CDK 4/6抑制剂的细胞抑制作用解释（补充图9a）。CDK 4/6抑制剂在更大范围的癌症类器官上的二次测试验证了CDK 4/6抑制剂的治疗效果与EGFR突变系中CDKN 2 A/B损失的存在之间的相关性（图5 B，补充图9 B）。值得注意的是，无论基线偏移或非基线偏移，具有CDKN 2 A/B损失的LUAD类器官对CDK 4/6抑制剂敏感（图5 B）。与EGFR突变型LUAD相比，KRAS突变型LUAD对CDK 4/6抑制剂相对耐药，尽管存在CDKN 2 A/B缺失（补充图9 c，d），表明CDK 4/6抑制剂的作用取决于LUAD的遗传背景。

为了研究CDK 4/6抑制剂的体内治疗效果，作者使用基底移位LUAD类器官（E14和E-17）、SQ-T（E-12）类器官和非基底移位LUAD类器官（E-01 B）产生小鼠异种移植物（图5c）。在异种移植物植入和生长（> 100 mm 3）后，用Palbociclib或溶剂处理小鼠3周。与体外数据一致，Palbociclib治疗抑制了基底移位LUAD类器官的生长，而对非基底移位LUAD类器官没有影响（图5d和补充图9 e）。Palbociclib还显示出对SQ-T类器官异种移植物的治疗作用，表明CDKN 2 A/B丢失而不是基底移位本身使CDK 4/6阻断变得脆弱（图5d）。这些发现提供了临床前证据，支持使用CDK 4/6抑制剂治疗EGFR-TKI耐药的基础移位LUAD伴CDKN 2A/B丢失。

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图5：CDK 4/6抑制剂对CDKN 2A/B缺失EGFR突变型肺癌的治疗作用

5. 基底样转换的临床意义

为了证实基础偏移转化的临床相关性，作者对在规定时间段（2017年1月至2023年12月）获得的再活检样本进行了病理学评价，包括分别对第1/2代EGFRTKI和奥希替尼获得耐药后获得的32和21份样本（补充图10a）。根据作者的观察，根据以下标准定义基础移位LUAD：（1）NKX 2 -1表达阳性<5%，（2）TAp 63或Δ Np 63表达，（3）AQP 5表达。这些标准诊断了该队列中的4例基础移位LUAD病例（图3g，补充图10 b）。这些样本表现出AQP 5和TAp 63或Δ Np 63的异源表达，偶尔两种标记物在不同程度上共表达（补充图10 c），验证了基础移位转化的存在。总之，ELCOL的综合表型、遗传和表观遗传分析鉴定了EGFR-TKI耐药肺癌中具有基线偏移特征的亚组（图5e，f）。

1.发现全新耐药机制： 首次鉴定并命名“基底样转换”，即EGFR突变LUAD在EGFR-TKI压力下获得部分鳞状特征（LUAD/SQ混合表型）而耐药的机制。

2.驱动机制： NKX2-1基因缺失是驱动基底样转换和获得EGFR-TKI耐药的关键分子开关，通过改变细胞身份和生长因子依赖性实现。

3.治疗新策略： 基底样转换LUAD常伴随CDKN2A/B缺失，对CDK4/6抑制剂（如帕博西利）高度敏感，为克服此类耐药提供了直接有效的临床转化方案。

4.宝贵资源库： 建立的ELCOL类器官生物库是研究肺癌耐药机制和筛选治疗方案的强大平台。

本研究通过构建世界领先的肺癌类器官生物库（ELCOL），结合单细胞转录组等多组学技术，系统揭示了EGFR-TKI耐药的全新机制“基底样转换”，阐明了NKX2-1缺失的核心驱动作用，并验证了CDK4/6抑制剂靶向治疗携带CDKN2A/B缺失的基底样转换耐药的有效性。这不仅深化了对肺癌耐药复杂性的理解，也为临床克服耐药提供了精准的治疗策略。

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